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May 03, 2023

Optimisation statistique de P(3HB

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9005 (2023) Citer cet article

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Le poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) [P(3HB-co-3HHx)] est un copolymère bactérien de la famille des polyhydroxyalcanoates (PHA), un bioplastique de nouvelle génération. Notre équipe de recherche a récemment mis au point une souche bactérienne nouvellement productrice de P(3HB-co-3HHx), Cupriavidus necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp. Cette souche peut produire du P(3HB-co-2% mol 3HHx) en utilisant de l'huile de palmiste brute (CPKO) comme seul substrat carboné. Cependant, l'amélioration de la production de copolymères P(3HB-co-3HHx) par cette souche n'a pas été étudiée jusqu'à présent. Ainsi, cette étude vise à améliorer la production de copolymères P(3HB-co-3HHx) contenant des compositions de monomères 3HHx plus élevées en utilisant la méthodologie de surface de réponse (RSM). Trois facteurs importants pour la production de copolymères P(3HB-co-3HHx), c'est-à-dire la concentration de CPKO, la concentration d'hexanoate de sodium et le temps de culture, ont été étudiés à l'échelle du flacon. En conséquence, un maximum de 3,6 ± 0,4 g/L de P(3HB-co-3HHx) avec 4 % en moles de compositions de 3HHx a été obtenu en utilisant la condition optimisée RSM. De même, la composition de monomère 3HHx plus élevée (5% en moles) a été obtenue lors de l'intensification de la fermentation dans un bioréacteur à agitateur de 10L. De plus, les propriétés du polymère produit étaient similaires à celles du P(3HB-co-3HHx commercialisable), ce qui rend ce polymère adapté à une large gamme d'applications.

La pollution plastique est devenue l'un des défis environnementaux mondiaux les plus critiques. De toute évidence, la pandémie de COVID-19 a contribué à une énorme augmentation des plastiques à usage unique à base de pétrole, par exemple des gants, des combinaisons médicales de protection, des masques, des bouteilles de désinfectant pour les mains, des plastiques à emporter, des contenants alimentaires et des kits de test médical1,2. Ces plastiques conventionnels ne sont pas biodégradables et peuvent rester dans les décharges et dans la mer pendant de nombreuses années, influençant considérablement la qualité du sol, l'activité microbienne, la faune et la flore3. En raison de leur entrée dans la chaîne alimentaire, cela entraîne un risque pour la santé humaine4. En raison de ces préoccupations, les plastiques biodégradables ayant peu ou pas d'impact sur l'environnement ont gagné en popularité en tant qu'alternatives aux plastiques à base de pétrole. En outre, ils devraient faire partie des futures économies circulaires qui contribueront à la réalisation de certains aspects des objectifs de développement durable (ODD) de l'ONU5,6.

Les polyhydroxyalcanoates (PHA) sont des polyesters produits dans la nature en tant que composé de stockage intracellulaire accumulé comme réserve d'énergie par certaines bactéries et archées dans des conditions de stress7,8. Les PHA sont des thermoplastiques aux propriétés comparables aux polymères traditionnels à base de pétrole tels que le polypropylène (PP) et le polyéthylène (PE)9,10. Fait intéressant, le polymère de la famille des PHA fait preuve d'une biodégradabilité exceptionnelle même lorsqu'il est exposé à l'eau de mer11, faisant des PHA un substitut prometteur aux plastiques à base de pétrole. Les PHA sont classés en deux groupes en fonction du nombre de carbones dans les constituants monomères : les PHA à chaîne courte (SCL-PHA, C3-C5), qui se composent de 3 à 5 monomères de carbone, et les PHA à chaîne moyenne (MCL -PHA, C6-C14), qui se composent de 6 à 14 monomères de carbone dans les unités 3-hydroxyalcanoate12,13.

Actuellement, plus de 150 types de PHA ont été identifiés14, y compris des homopolymères et des copolymères, par exemple, poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB], poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) [P(3HB-co -4HB)], poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalérate) [P(3HB-co-3HV)], poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexonate) [P(3HB-co-3HHx)] Parmi les copolymères PHA, le poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy hexanoate) [P(3HB-co-3HHx)] est remarquablement souhaitable en raison de sa flexibilité supérieure et de sa ressemblance avec divers polymères populaires à base de pétrole, ce qui le rend plus applicable aux applications pratiques que l'homopolymère rigide P (3HB) 15, 16. En outre, en raison de son excellente biocompatibilité et de sa biodégradabilité, le P (3HB-co-3HHx) est un copolymère candidat approprié pour les applications biomédicales 17.

Néanmoins, les utilisations commerciales des polyhydroxyalcanoates (PHA) ont été limitées par le coût de fabrication relativement élevé par rapport aux polymères pétrochimiques concurrents. Ainsi, l'amélioration du milieu de fermentation est un domaine de recherche critique depuis son impact significatif à la fois sur la croissance des cellules et l'expression des métabolites désirables, contribuant à la productivité totale18. La méthodologie de surface de réponse (RSM) est une approche d'optimisation statistique qui utilise des conceptions factorielles expérimentales, telles que la conception composite centrale (CCD) et la conception de Box-Behnken (BBD), qui sont les principales conceptions de surface de réponse pour optimiser le rendement du processus et spécifie le comportement de la réponse. dans l'espace de conception spécifié19,20. Les deux conceptions examinent l'impact de l'interaction des éléments qui influencent considérablement le développement du produit. Les essais expérimentaux CCD et BBD sont utilisés pour RSM afin d'établir le modèle mathématique qui relie les paramètres de processus aux résultats21. Cependant, BBD nécessite généralement moins de points de conception que CCD, ce qui peut entraîner un modèle de régression de moins bonne qualité.

Les souches recombinantes productrices de PHA avec des gènes codant pour des enzymes de synthèse de PHA provenant de diverses bactéries ont été développées pour générer plus efficacement des PHA de longueur de chaîne courte à longueur de chaîne moyenne (SCL-MCL)22. Notre groupe de recherche a récemment mis au point une nouvelle souche bactérienne productrice de P(3HB-co-3HHx), C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24. Cette souche a produit 3,1 ± 0,3 g/L de copolymère P(3HB-co-3HHx) contenant 2 % en moles de composition de monomère 3HHx lors de l'utilisation de 10 g/L d'huile de palmiste brute (CPKO) comme seule source de carbone24. Cependant, un milieu de culture optimal et les conditions de production de PHA par cette souche doivent être améliorés pour maximiser le rendement de P(3HB-co-3HHx). Ainsi, cette étude vise à optimiser les conditions de fermentation de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en utilisant RSM pour améliorer la production de P(3HB-co-3HHx). En outre, la fermentation a été réalisée dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L pour augmenter la production de P(3HB-co-3HHx). Enfin, les propriétés de ce polymère ont été évaluées pour confirmer que ce polymère est prometteur pour diverses applications.

La composition optimale du milieu et les conditions de culture pour la production de P(3HB-co-3HHx) et les effets d'interaction de chaque paramètre ont été déterminés à l'aide d'une conception CCD à trois variables et cinq niveaux. Les variables CCD comprenaient la concentration de CPKO, g/L(X1), la concentration d'hexanoate de sodium, g/L(X2) et le temps de culture, h(X3). Les résultats expérimentaux de la production de P(3HB-co-3HHx) et les réponses prédites sont présentés dans le tableau 1. Les résultats ont révélé que la production de P(3HB-co-3HHx) la plus élevée (série 6), 3,54 g/L, a été obtenue lorsque la concentration de CPKO, d'hexanoate de sodium et le temps de culture étaient de 15 g/L, 1,0 g/L et 54 h, respectivement. Alors que la production la plus faible de P(3HB-co-3HHx) (essai 3) était de 0,53 g/L lorsque les concentrations de CPKO, d'hexanoate de sodium et le temps de culture étaient de 5 g/L, 3,0 g/L et 42 h, respectivement. Les résultats de l'expérience CCD des analyses de régression multiple ont été ajustés à un modèle polynomial du second ordre. Le modèle suivant a été utilisé pour ajuster la production de P(3HB-co-3HHx) en termes de variables codées.

où Y est la production de P(3HB-co-3HHx) et X1, X2 et X3 sont des valeurs codées de CPKO, d'hexanoate de sodium et de temps de culture, respectivement.

Le test F et l'ANOVA pour le modèle quadratique de surface de réponse ont confirmé la signification statistique de l'équation. R2 = 0,9885 était le coefficient de détermination dans l'équation de régression de cette étude (tableau 2). Par conséquent, ce modèle peut rendre compte d'environ 98,85 % de la variabilité de la variable dépendante ; les 1,15 % restants ont été influencés par d'autres facteurs. Alors que le R2 modifié, qui tient compte de la taille de l'échantillon et du nombre de termes25, était de 0,9782. Les valeurs de R2 sont constamment comprises entre 0 et 1. Plus le R2 est élevé, plus le modèle est influent et mieux il prédit la réponse21. Les valeurs P sont utilisées pour évaluer la signification de chaque coefficient, ce qui contribue à comprendre le modèle d'interactions mutuelles entre les variables26. Plus la significativité du coefficient correspondant27 est forte, plus la valeur P est petite. Le test F et les valeurs P correspondantes ont été estimés, comme indiqué dans le tableau 2. Le modèle indique que les termes constants linéaires (X1, X2, X3), quadratiques (X12, X22, X32) et d'interaction (X1X3 et X2X3) sont significatifs (P < 0,05) (Tableau 2). Cependant, étant donné que la valeur P de toutes les variables (X1, X2 et X3) était inférieure à 0,0001, elle indique à peine quelles variables sont les plus significatives pour la production de P(3HB-co-3HHx).

Le coefficient polynomial négatif en termes d'interaction dans ce modèle suggère que l'interaction est oppositionnelle. La valeur F d'absence d'ajustement de 1,26 (tableau 2) indique que l'absence d'ajustement n'est pas statistiquement significative par rapport à l'erreur type. Cette valeur F élevée de non-ajustement a une probabilité de 40,36 % de se produire en raison du bruit.

Pour évaluer l'interaction entre différents paramètres et déterminer la valeur optimale de chaque paramètre pour une production maximale de P(3HB-co-3HHx), la réponse entre CPKO(X1), l'hexanoate de sodium(X2) et le temps de culture CPKO (X3) ont été tracées comme le montre la figure 1. La figure 1A montre l'effet du CPKO et de l'hexanoate de sodium sur la production de P(3HB-co-3HHx). La production de P(3HB-co-3HHx) a augmenté lorsque la concentration de CPKO est passée de 5,0 à 15,0 g/L. À une concentration inférieure de CPKO (< 5,0 g/L), la production de P(3HB-co-3HHx) a diminué. Tandis que la production de P(3HB-co-3HHx) augmentait avec la diminution de la concentration d'hexanoate de sodium, passant de 3,0 à 1,0 g/L. À une concentration plus élevée d'hexanoate de sodium (> 3,0 g/L), la production de P(3HB-co-3HHx) a considérablement diminué.

Surface de réponse et tracés de contour décrits par le modèle, représentant la production de P(3HB-co-3HHx) (g/L) en tant que valeur de CPKO, d'hexanoate de sodium et de temps de culture par C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. L'effet combiné du CPKO et de l'hexanoate de sodium (A); CPKO et temps de culture (B); hexanoate de sodium et temps de culture (C).

Selon les graphiques RSM 3D et les courbes de contour 2D de CPKO (X1) et le temps de culture (X2) sur la production de P (3HB-co-3HHx) (Fig. 1B), il a été montré que le P (3HB-co-3HHx) la production s'est considérablement améliorée lorsque le CPKO a été augmenté de 5,0 à 15,0 g/L. Dans le même temps, il a été réduit lorsque la concentration de CPKO est tombée en dessous de 5,0 g/L. Par ailleurs, la production de P(3HB-co-3HHx) augmentait lorsque le temps de culture passait de 54 à 42 h. Néanmoins, à mesure que le temps de culture augmentait (> 54 h), la production de P(3HB-co-3HHx) diminuait considérablement.

L'effet de l'hexanoate de sodium et le temps de culture sont représentés sur la figure 1C. La production de P(3HB-co-3HHx) a augmenté avec la diminution de l'hexanoate de sodium, passant de 3,0 à 1,0 g/L. Alors que la production de P(3HB-co-3HHx) diminuait considérablement à une concentration plus élevée d'hexanoate de sodium (> 3,0 g/L) et augmentait avec un temps prolongé, de 42 à 54 h. De plus, la production de P(3HB-co-3HHx) diminuait lorsque le temps de culture était inférieur à 42 h.

Le modèle a été vérifié pour les trois facteurs dans l'espace de conception afin de valider les prédictions d'optimisation. La composition et les conditions du milieu optimisées par RSM ont été testées en triple sur une échelle de 250 flacons. Les résultats démontrent que dans les conditions suivantes : CPKO, 14,4 g/L, hexanoate de sodium, 1,7 g/L et 43 h de temps de culture, la production maximale de P(3HB-co-3HHx) de 3,63 ± 0,4, avec 5,54 ± 0,8 g/L de DCW a été obtenu, se rapprochant de la production prévue de P(3HB-co-3HHx) de 3,55 g/L. Les valeurs prédites et expérimentales ont été comparées et le résidu a été calculé. La différence relative entre les niveaux de production réels et prévus de P(3HB-co-3HHx) était de 0,3 %. En conséquence, les modèles observés sont très précis et l'analyse RSM est une approche appropriée pour prédire et améliorer le milieu et les conditions de fermentation.

La culture par lots a été réalisée dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L pour améliorer la biomasse cellulaire et la production de P (3HB-co-3HHx) de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. La fermentation a été réalisée dans un bioréacteur contenant 6 L de milieu optimisé RSM (CPKO, 14,4 g/L, hexanoate de sodium, 1,7 g/L). La température, le pH, le taux d'aération et la vitesse d'agitation ont été fixés à 30 °C, 6,8, 0,25 vvm et 200 tr/min, respectivement. La croissance et la production de P(3HB-co-3HHx) de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp ont lentement augmenté au cours de la fermentation de 48 h. Comme le montre la figure 2, la biomasse a augmenté progressivement au cours de la fermentation. Cependant, lorsque la période de fermentation a été prolongée au-dessus de l'optimum (42 h), la production de P(3HB-co-3HHx) et la croissance cellulaire ont été interrompues et la dégradation de P(3HB-co-3HHx) a commencé28. La production la plus élevée de P(3HB-co-3HHx) était à 42 h lorsque la DCW était de 6,2 ± 0,3 g/L ; La production de P(3HB-co-3HHx) était de 3,9 ± 0,3 g/L (Fig. 2). En outre, il convient de noter que la fraction supérieure de monomères 3HHx (5 % en moles) a été obtenue lors de la culture de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L.

Profil de fermentation discontinue de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp p dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L.

Le copolymère P(3HB-co-5 mol% 3HHx) extrait produit à partir de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp a été caractérisé par RMN 1H, FTIR, DSC et TGA pour comprendre les caractéristiques structurelles et thermiques du copolymère pour d'autres applications. La RMN 1H a été réalisée pour vérifier la présence de monomère 3HHx dans le copolymère synthétisé par la souche C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. La figure 3 illustre la bande RMN 1H de H4, correspondant aux groupes méthylène C4, et la bande RMN 1H de H6, correspondant au groupe méthyle C6, indiquant la formation du copolymère P(3HB-co-3HHx)15,24,29 . Les fractions de monomères du copolymère ont été calculées en fonction du rapport d'intensité du spectre 1H des composants méthyles30. Les valeurs des fractions de monomères 3HHx produites étaient légèrement supérieures à celles observées par analyse GC gaz, avec une variation de 1 % mol.

Spectre de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H) de P(3HB-co-3HHx) produit par C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp dans un bioréacteur à cuve agitée de 10L.

Les spectres d'absorption FTIR ont été scannés dans la plage de 4000 à 400 cm-1. Les spectres FTIR du copolymère synthétisé par C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp sont représentés sur la Fig. 4. Le pic d'absorption principal de P(3HB-co-3HHx) a été observé dans le spectre à 1720,98 cm−1, ce qui correspond à la vibration d'étirement de la liaison ester carbonyle (C=O)31,32. Alors que la vibration d'étirement asymétrique C–O–C provoque le pic d'absorption à 1269,35 cm − 133. L'étirement C–H et le groupe –CH étaient représentés par les autres bandes distinctives situées à 2976,37 cm−1 et 1221,72–1375,09 cm−1 , respectivement34,35. Pour la phase amorphe, les vibrations d'étirement C–O et C–C ont été attribuées à une série de bandes d'absorption allant de 1179,79 à 606,08 cm−133.

Spectre de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée (ATR-FTIR) de P (3HB-co-3HHx) produit par C. necator PHB-4 / pBBR_CnPro-phaCRp dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L.

Les propriétés thermiques du copolymère P (3HB-co-5 % en moles de 3HHx) produit par C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp ont été analysées par DSC et TGA. La figure 5 montre le thermogramme de la température de fusion (Tm), la température de transition vitreuse (Tg), tandis que la figure 6 montre les températures de dégradation (Td) du copolymère. Les valeurs ont été enregistrées à partir du deuxième chauffage pour éliminer l'histoire thermique des échantillons précédents. Le thermogramme du copolymère extrait a révélé deux températures de fusion (Tm1 et. Tm2) à environ 129 et 144 ° C (Fig. 5). Les Tc, Tg et Td du copolymère étaient respectivement d'environ 89, 1,6 (Fig. 5) et 260,6 °C (Fig. 6).

Analyse par calorimétrie à balayage différentiel (DSC) du P(3HB-co-3HHx) produit par C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L.

Analyse thermogravimétrique (TGA) du P(3HB-co-3HHx) produit par C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp dans un bioréacteur à cuve agitée de 10L.

Les PHA sont des matériaux polymères biodégradables produits à partir de bactéries et d'archées dans des conditions de stress telles que des concentrations limitant les nutriments d'azote, de phosphore, de soufre ou d'oxygène et des sources de carbone en excès7,8,36. Apparemment, les ASP deviennent un problème de plus en plus important dans la communauté scientifique ainsi que dans le secteur des affaires. Cela permet de réapprovisionner les polymères synthétiques, établissant finalement l'économie circulaire souhaitée. P(3HB-co-3HHx) est un type pratique de copolymère PHA. Il a une température de fusion et une cristallinité inférieures à celles de l'homopolymère P(3HB), ce qui peut être attribué à la longue chaîne latérale de l'unité 3-hydroxyhexanate (3HHx)37. Les copolymères sont composés de 5 à 15% en moles de 3HHx et ont des propriétés élastiques qui les rendent adaptés à diverses applications38.

Auparavant, Han et al. ont rapporté que les souches de type sauvage, Aeromonas spp., peuvent produire du P(3HB-co-3HHx) à partir d'huiles végétales et d'acides gras via la PHA synthase, qui a une spécificité de substrat particulièrement large pour les (R)-3-hydroxyacyl-CoAs de C4-C639. Dans cette étude, le copolymère P(3HB-co-3HHx) a été synthétisé par C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24, une souche bactérienne nouvellement conçue, et la production de P(3HB-co-3HHx) a été améliorée en utilisant RSM. Les résultats ont montré que les 3,6 ± 0,4 g/L les plus élevés de P(3HB-co-4 % en moles de 3HHx) ont été obtenus en utilisant les conditions optimisées RSM à l'échelle du ballon. En outre, la composition en monomères 3HHx a été augmentée à 5% en moles lors de la culture de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp dans le bioréacteur de 10L pendant 48 h de fermentation. Ce résultat était similaire au résultat obtenu par Ouyang et al.40. Ils ont réalisé les expériences de flacon agité pour produire du P (3HB-co-3HHx) à partir d' Aeromonas hydrophila , dont la composition en monomères contrôlable de 15% dans le type sauvage à 3-12% dans le recombinant en modifiant fondamentalement le rapport gluconate à laurique acide dans les milieux de culture en 48 h de fermentation. La production de P(3HB-co-3HHx) étudiée chez Cupriavidus sp. a été rapporté par Volova et al.22, C. eutrophus B10646 pourrait produire des rendements de biomasse significatifs (5,6 g L−1), et une teneur élevée en polymère (60–75 %), y compris une fraction molaire 3HHx élevée, sous la conditions de croissance adéquates. Cependant, les caractéristiques physico-chimiques et mécaniques des copolymères P(3HB-co-3HHx) peuvent être modifiées en ajustant le rapport 3HB/3HHx. Par ailleurs, Kawashima et al.41 ont trouvé que la région en aval de phaP1Re était un site avantageux pour l'intégration de gènes surexprimés lors de l'accumulation de PHA chez R. eutropha. Les résultats ont également démontré que les caractéristiques de polymérisation de la PHA synthase étaient influencées par le type de phasine qui coexistait à la surface des granules de PHA, modifiant le polymère PHA résultant (3HB-co-3HHx). Le remplacement de la phasine est une méthode technique innovante pour contrôler la composition des copolyesters PHA. De plus, Murugan et al.42 ont étudié l'oléine de palme (PO) et le fructose comme sources de carbone pour la biosynthèse de P(3HB-co-3HHx) par C. necator Re2058/pCB113 recombinant. Les cultures en flacon agité utilisant 5 g/L PO comme seule source de carbone ont donné un poids sec cellulaire (CDW) de 5,13 g/L, 67 % PHA/CDW et un copolymère comprenant 27 % en moles de 3HHx. Le P (3HB-co-3HHx) avec 4 à 15% en moles de monomère 3HHx avait des poids moléculaires compris entre 5, 47 et 6, 85 × 105 Da, soit au moins deux fois plus que les valeurs précédemment rapportées.

Dans cette étude, RSM utilisant CCD a été appliqué pour améliorer la production de P(3HB-co-3HHx) à l'échelle d'un flacon. Le résultat montre que dans les conditions suivantes : CPKO, 14,4 g/L, hexanoate de sodium, 1,7 g/L et 43 h de temps de culture, la production maximale de P(3HB-co-3HHx) de 3,63 ± 0,4 a été obtenue, se rapprochant le RSM prévoyait une production de P(3HB-co-3HHx) de 3,55 g/L. Ces résultats ont prouvé la précision du modèle RSM pour la production de P(3HB-co-3HHx). En outre, par rapport à la condition non optimisée, le milieu optimisé peut améliorer la production de composition de monomères P(3HB-co-3HHx) et 3HHx de 1,2 et deux fois, respectivement. Sur cette base, l'amélioration de la production de P(3HB-co-3HHx) était légèrement présente, cependant, la composition du monomère 3HHx a été améliorée avec succès par RSM. Auparavant, le RSM était considéré comme une méthode efficace pour améliorer la biosynthèse des PHA par de nombreux micro-organismes43,44,45,46,47. Cependant, l'utilisation de RSM pour améliorer la production de P(3HB-co-3HHx) a été limitée.

L'application de la fermentation discontinue par diverses bactéries pour augmenter la biosynthèse de PHA dans le bioréacteur a été rapportée48,49,50,51,52. Cependant, dans la présente étude, la production de P(3HB-co-3HHx) ne peut pas être améliorée en utilisant cette approche. Seule la composition du monomère 3HHx a été augmentée à 5% en moles, ce qui peut être lié à la période de récolte réduite. De plus, les cultures discontinues sont faciles à mettre en œuvre mais ont une faible productivité intrinsèque en raison de la concentration restreinte des apports de carbone et d'azote au début de la fermentation53. En revanche, la méthode de fermentation fed-batch produit une concentration cellulaire élevée, améliore la productivité et réduit l'inhibition du substrat ou du produit final54.

Dans cette étude, le copolymère P(3HB-co-3HHx) contenant 5% en moles de composition de monomère 3HHx a été synthétisé par la souche modifiée, C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp en utilisant respectivement CPKO et hexanoate de sodium comme carbone et précurseur. . Le copolymère a été extrait et caractérisé pour comprendre les caractéristiques structurelles et thermiques du copolymère pour une utilisation ultérieure. Le spectre RMN 1H a confirmé l'existence du monomère 3HHx dans les copolymères P(3HB-co-3HHx) synthétisés par C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. Il était similaire aux spectres RMN 1H rapportés par Wong et al.30 et Bhubalan et al.55. En outre, selon le calcul de la composition du monomère 3HHx à partir des spectres RMN 1H, ce polymère contient 5 à 6% en moles de monomère 3HHx, similaire aux résultats de l'analyse GC. Les spectres FTIR du copolymère ont démontré le pic d'absorption caractéristique des copolymères P(3HB-co-3HHx) à 1720,98 et 1269,35 cm−1, ce qui correspond à la vibration d'étirement de la liaison ester carbonyle (C=O) et C–O– asymétrique C vibration d'étirement, respectivement31,32. Ces résultats ont établi que le copolymère produit était P(3HB-co-3HHx).

Les propriétés thermiques du copolymère P (3HB-co-5 % en moles de 3HHx) produit par C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp ont été analysées par DSC et TGA. Le thermogramme DSC du copolymère extrait a révélé deux températures de fusion (Tml et Tm2) à environ 129 et 144 °C. Deux températures de fusion des mcl-PHA sont détectables, ce qui peut être lié à la formation de deux phases cristallines différentes (phase I et phase II)56. Les Tc, Tg et Td du copolymère étaient de 89, 1,6 et 260,6 °C, respectivement. Ces résultats sont similaires à ceux précédemment étudiés par Murugan et al.42. Ils ont rapporté que la Tm et la Tg du P(3HB-co-4 % en moles de 3HHx) produit à partir de C. necator Re2058/pCB113 étaient respectivement de 164 et − 1 °C.

Le P(3HB) Td a été rapporté à 280 °C56,57,58. Le copolymère Td dans cette étude était inférieur en raison de l'incorporation du monomère 3HHx. En général, les copolymères P(3HB-co-3HHx) avaient une Tm et une Td inférieures à celles du P(3HB), bien qu'il n'y ait pas d'association perceptible entre ces caractéristiques et les fractions molaires de 3HHx22.

Dans cette étude, la production des copolymères P(3HB-co-3HHx) par une souche modifiée de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp a été améliorée à l'aide de RSM. Dans des conditions optimales de RSM, cette souche peut produire 3,6 ± 0,4 de P(3HB-co-3HHx) contenant 4 % en moles de compositions de 3HHx. Par rapport à la condition non optimisée, le milieu optimisé peut améliorer la production de composition de monomères P(3HB-co-3HHx) et 3HHx de 1,2 et deux fois, respectivement. En outre, il est intéressant de noter que la composition du monomère 3HHx a été augmentée à 5% en moles lors de l'exploitation de la fermentation dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L, ce qui était 2, 5 fois plus élevé que la condition non optimisée. Les résultats du groupe fonctionnel et de la structure chimique ont vérifié que le polymère était P(3HB-co-3HHx), et les propriétés thermiques du polymère produit étaient similaires à celles du P(3HB-co-3HHx) industriel.

La souche recombinante C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp a été cultivée comme décrit par Trakunjae et al.24. En bref, la souche bactérienne a été cultivée sur de la gélose riche en nutriments (NR) additionnée de 50 µg/mL de kanamycine à 30 °C pendant 24 h. Ensuite, trois boucles complètes d'une colonie bactérienne ont été transférées dans du milieu NR additionné de 50 µg/mL de kanamycine pour préparer l'inoculum bactérien. Après cela, incuber les flacons d'inoculum à 30 ° C avec agitation de 200 tr/min pendant 8 h ou jusqu'à ce que la densité optique (OD600) atteigne 4.

L'inoculum à 3% v/v de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp a été transféré dans le milieu de production P(3HB-co-3HHx). Le milieu minéral (MM) pour la production de P(3HB-co-3HHx) était composé de 0,45 g/L de K2SO4, 4,6 g/L de Na2HPO4, 4,0 g/L de NaH2PO4, 0,54 g/L de CO(NH2)2 [ Urée], 0,39 g/L de MgSO4, 0,062 g/L de CaCl2 et 1 mL/L de solution d'oligoéléments (ET)59. La solution TE comprenait ZnSO4·7H2O, 2,4 g/L ; FeSO4·7H2O, 15 g/L ; MnSO4·H2O, 2,4 g/L, et CuSO4·5H2O, 0,48 g/L dissous dans HCl 0,1 M. Le pH du MM a été ajusté à 6,8 avant la stérilisation. CPKO, hexanoate de sodium et CaCl2 ont été stérilisés séparément à 121 ° C pendant 20 min. Tandis que l'urée et la solution de TE ont été filtrées à l'aide d'un filtre à membrane stérile de 0,2 um et ajoutées au milieu stérilisé à la concentration requise. La biosynthèse de P(3HB-co-3HHx) de C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp a été réalisée à 30 °C sous agitation de 200 tr/min pendant 48 h.

Les cellules bactériennes ont été récoltées par centrifugation à 8 000 tr/min, 4 °C pendant 10 min. Après cela, les culots cellulaires ont été lavés avec de l'eau distillée (DW), suivie d'une solution mixte de DW et d'hexane dans un rapport de 1: 1 pour éliminer les résidus d'huile. Ensuite, les pastilles cellulaires ont été relavées avec DW pour éliminer les restes d'hexane et transférées dans une bouteille de bijoux pré-pesée. Ensuite, les bouteilles contenant des culots de cellules bactériennes ont été congelées à - 20 ° C pendant une nuit et lyophilisées à l'aide d'un lyophilisateur jusqu'à ce qu'elles soient complètement sèches. Enfin, le poids de la cellule lyophilisée a été enregistré en g/L. Dans le même temps, la teneur en PHA et la composition des monomères ont été examinées par analyse par chromatographie en phase gazeuse (GC).

RSM, une méthode de modélisation pratique, est un ensemble d'outils statistiques et mathématiques pour créer des expériences et optimiser les variables de processus d'influence60. Dans cette étude, la production de copolymères P(3HB-co-3HHx) a été améliorée en utilisant le RSM basé sur la conception composite centrale (CCD). Il est couramment utilisé pour construire un polynôme du second ordre pour les variables de réponse sans un plan factoriel complet d'expériences.

Trois facteurs significatifs ont été utilisés dans cette étude, à savoir le CPKO (g/L) (X1), l'hexanoate de sodium (g/L) (X2) et le temps de culture (h) (X3). Chaque variable a été codée à cinq niveaux (1,68, 1, 0, + 1 et + 1,68) sur la base du plan CCD pour définir les caractéristiques de la surface de réponse dans la région optimale. Un total de vingt cycles de fermentation ont été conçus selon l'Eq. (1), y compris cinq cycles de fermentation répliqués aux points centraux.

où k est le nombre de variables indépendantes et n0 est le nombre de répétitions d'expériences au point central

Les niveaux codés et réels des facteurs significatifs sont présentés dans le tableau 3. La matrice de conception des essais de fermentation testés est présentée dans le tableau 1. Les valeurs moyennes ont été rapportées à partir d'essais expérimentaux en triple. Le logiciel Design-Expert v7.0.0 (Stat-Ease, Inc. MN, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique des résultats. Les résultats expérimentaux de la conception CCD ont été ajustés avec une équation polynomiale du second ordre par des techniques de régression multiple, comme indiqué dans l'équation. (2).

où Y est la réponse mesurée prédictive ; Xi et Xj sont les variables indépendantes ; β0 représente l'ordonnée à l'origine ; et βi, βii et βlj sont les coefficients de régression du modèle61. Le modèle généré pour trois variables indépendantes est présenté dans l'équation. (3).

où Y est la réponse prévue de la production de P(3HB-co-3HHx) (g/L); β1, β2 et β3 sont des coefficients linéaires ; β11, β22 et β33 représentent des coefficients quadratiques ; β12, β13 et β23 sont des coefficients d'interaction ; X1, X2 et X3 représentent les valeurs codées de CPKO (X1), d'hexanoate de sodium (X2) et de temps de culture (X3).

Les valeurs des trois facteurs testés, CPKO, hexanoate de sodium et temps de culture, ont été choisies au hasard dans l'espace de conception pour vérifier la production de P(3HB-co-3HHx) par C. necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp dans un shake modèle de flacon. Dans cette expérience, les autres composants du milieu étaient à des niveaux fixes.

La fermentation a été effectuée dans un bioréacteur à cuve agitée de 10 L (modèle MDFT-N-10L, Marubishi, Japon) pour améliorer la production de P(3HB-co-3HHx) par C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp. Les 3 % v/v d'inoculum bactérien ont été transférés dans le bioréacteur contenant 6 L de milieu optimisé. La culture discontinue a été effectuée à 30 °C avec un pH initial et des vitesses d'agitation de 6,8 et 200 tr/min, respectivement. Le pH du bouillon de culture a été maintenu à pH 6,8 pendant la fermentation en ajoutant HPO3 ou NaOH à l'aide d'un régulateur de pH. Le débit d'air a été fixé à 0,25 vvm. La biomasse cellulaire et la production de P(3HB-co-3HHx) ont été évaluées toutes les 6 h pendant 48 h de fermentation. Les fermentations ont été réalisées en triple et des valeurs moyennes ont été déterminées.

Les 10 g de cellules lyophilisées ont été dissoutes dans 1 L de chloroforme et agitées pendant 3 à 5 jours à température ambiante pour extraire les copolymères P (3HB-co-3HHx). Ensuite, les débris cellulaires ont été éliminés en filtrant la suspension de cellules bactériennes à l'aide de papier filtre (Whatman n° 1). Après cela, la solution de chloroforme dissous P (3HB-co-3HHx) a été évaporée à environ 100 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif. La solution évaporée a ensuite été ajoutée goutte à goutte à 100 ml de méthanol glacé et agitée pendant 1 h. Enfin, le polymère purifié a été séparé par filtration à l'aide d'une membrane PTFE de 0,45 µm et séché à l'air pendant 3 à 5 jours44 avant d'être utilisé pour d'autres expériences.

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H) est une technique simple pour étudier la composition du polymère PHA. Dans cette étude, les copolymères P(3HB-co-3HHx) purifiés ont été dissous dans du chloroforme deutéré (CDCl3) à 25 mg/mL pour être soumis à une analyse RMN. La RMN 1H en solution a été réalisée sur un spectrophotomètre Jeol JNM-ECZ-400R/S1 (JEOL, Ltd., Tokyo, Japon) résonnant à 500 MHz. Les déplacements chimiques ont été rapportés au tétraméthylsilane (TMS). Dans le même temps, l'adamantane était utilisé comme étalon externe.

Les groupes fonctionnels des copolymères P(3HB-co-3HHx) purifiés ont été détectés par spectroscopie IR à transformée de Fourier (FTIR). L'analyse FTIR a été réalisée à l'aide d'un spectromètre FTIR (Thermo Scientific Nicolet IR200, Waltham, MA, USA). Les 128 scans ont été composés en mode réflexion totale atténuée (ATR). De plus, les spectres ont été obtenus dans la gamme de 4000 à 400 cm-1 avec une résolution de 4 cm-1.

Les copolymères P(3HB-co-3HHx) purifiés ont été analysés pour leurs propriétés thermiques en utilisant la calorimétrie à balayage différentiel (DSC) et l'analyse thermogravimétrique (TGA). L'analyse DSC a été analysée par DSC25 (TA instruments, New Castle, DE, USA) en utilisant un débit d'azote de 30 mL/min. Environ 3 à 5 mg de copolymères P (3HB-co-3HHx) purifiés ont été versés dans une casserole hermétique en aluminium Tzero, recouverts et chauffés de 25 à 200 ° C à une vitesse de chauffage de 15 ° C/min. Les échantillons fondus ont ensuite été maintenus à 200 ° C pendant 2 min et une réduction rapide à - 40 ° C. Enfin, ils ont été chauffés à plusieurs reprises de − 40 à 200 °C à une vitesse de chauffage de 15 °C/min. La température de fusion (Tm), la température de cristallisation (Tc) et la température de transition vitreuse (Tg) ont été détectées et analysées à partir du thermogramme DSC. Pour l'analyse TGA, environ 5 mg des copolymères P (3HB-co-3HHx) purifiés ont été versés dans un bac en aluminium et analysés à l'aide de l'instrument Pyris 1 TGA (Perkin Elmer, USA). La température de chauffage a été réglée de 30 à 900 °C à une vitesse de chauffage de 20 °C/min sous une atmosphère d'azote.

La détermination de DCW a été modifiée par Trakunjae et al.24. En bref, 1 ml de suspension de culture cellulaire a été transféré dans les tubes Eppendorf pré-pesés et centrifugé à 8 000 tr/min pendant 10 min. Ensuite, les cellules récoltées ont été lavées avec de l'eau distillée, suivie d'une solution mixte de DW et d'hexane dans un rapport de 1: 1 pour éliminer les résidus d'huile. Puis lavé avec DW pour éliminer les restes d'hexane et centrifugé à 8 000 tr/min pendant 10 min. Ensuite, les culots cellulaires obtenus ont été congelés à - 20 ° C pendant la nuit et lyophilisés à l'aide d'un lyophilisateur pendant 2 à 3 jours. Enfin, les tubes Eppendorf contenant des cellules lyophilisées ont été pesés pour vérifier la stabilité et ont calculé la DCW en g/L.

La teneur en PHA et la composition en monomères ont été analysées par la technique de méthanolyse selon Braunegg et al.62. En bref, 15 à 20 mg de cellules lyophilisées ont été ajoutés au tube à essai, suivis de 2 mL de solution de chloroforme et de méthanolyse (mélange de 85 % v/v de méthanol et 15 % w/v H2SO4). Les tubes ont été chauffés à 100 ̊ C pendant 180 min, puis refroidis à température ambiante. Après cela, 1 ml de DW a été ajouté dans les tubes et mélangé vigoureusement pendant 1 min à l'aide d'un mélangeur vortex. Le PHA riche en chloroforme dans la couche inférieure a été recueilli à l'aide d'une pipette de pâturage. Ensuite, retirez les résidus d'eau à l'aide de Na2SO4. La solution de mélange de 500 ml de solution de PHA riche en chloroforme et de 500 ml d'ester méthylique caprylique (CME) à 0,2 % (v/v) (étalon interne) a été préparée pour l'analyse GC. L'analyse a été réalisée à l'aide de Shimadzu GC-2014 plus (Shimadzu, Japon) fourni avec une colonne Restek RTX-1 (Restek, USA) et un détecteur à ionisation de flamme (FID). Les 2,0 µL de la solution d'échantillon préparée ont été injectés dans la machine GC. L'azote a été utilisé comme gaz porteur pour l'analyse GC. De plus, les températures de l'injecteur et du détecteur ont été fixées respectivement à 270 °C et 280 °C.

Toutes les données expérimentales ont été décrites comme moyenne ± erreur standard. L'analyse statistique a été réalisée par le logiciel SPSS Statistics 17.0 (SPSS for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Les réponses expérimentales ont été examinées à l'aide d'une analyse de variance à deux voies (ANOVA). Les coefficients de régression linéaire, quadratique et d'interaction de chaque terme du modèle ont été calculés à l'aide de la valeur F à une probabilité (P) < 0,05. De plus, la signification statistique de chaque terme du polynôme a été analysée et tous les coefficients ont été étudiés à l'aide du logiciel Design-Expert® v7.0.0 (Stat-Ease, Inc. MN, USA).

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié. La correspondance et les demandes de matériel doivent être adressées à C. Trakunjae ou P. Vaithanomsat.

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Ce travail a été soutenu financièrement par l'Institut de recherche et de développement de l'Université de Kasetsart (KURDI), numéro de subvention FF(KU)28.65.

Institut d'amélioration des produits agricoles et agro-industriels de Kasetsart (KAPI), Université de Kasetsart, Bangkok, 10900, Thaïlande

Chanaporn Trakunjae, Antika Boondaeng, Waraporn Apiwatanapiwat, Phornphimon Janchai & Pilanee Vaithanomsat

Laboratoire de recherche sur les écobiomatériaux, École des sciences biologiques, Universiti Sains Malaysia USM, 11800, Penang, Malaisie

Bientôt Zher Neoh & Kumar Sudesh

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Conceptualisation, rédaction—préparation du brouillon original, CT ; Révision et édition, CT, PV et KS ; Administration du projet et acquisition de financement, PV et CT ; Méthodologie et analyse des données, CT, SZN, AB, WA et PJ Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Pilanee Vaithanomsat.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Trakunjae, C., Boondaeng, A., Apiwatanapiwat, W. et al. Optimisation statistique de la production de copolymères P(3HB-co-3HHx) par Cupriavidus necator PHB−4/pBBR_CnPro-phaCRp et caractérisation de ses propriétés. Sci Rep 13, 9005 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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Reçu : 14 février 2023

Accepté : 29 mai 2023

Publié: 02 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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